在这项研究中，科学家们克服了许多技术难题，成功实现了丹尼斯·伽（Dennis Gabor）全息照相技术优势与当下结构生物学中最重要的技术冷冻电镜技术的结合。

此项研究得到了日立高新公司的部分技术支持。

用电子观察：科学家为更廉价和更容易获得的cryo-EM铺平道路

研究人员表示，该技术显微镜可获得高达纳米级图像分辨率，虽然远低于传统冷冻电镜埃米级近原子分辨率，但对于更高要求的科研工作，此类技术也足可以作为预筛查显微镜，填补重要的市场。如，由于低能电子与冰有很强的相互作用，因此，此种更便宜，更友好的显微镜可以帮助研究人员在使用常规冷冻电镜花费宝贵时间和金钱之前，评估其冰的质量。

将病毒、蛋白质和其他小生物分子的结构可视化，可以帮助科学家更深入地了解这些分子如何工作及其功能，从而可能会带来新的疾病治疗方法。近年来，一种被称为冷冻电镜(cryo-EM)的强大技术（将冰冻样品嵌入玻璃状冰中并用电子束探测）已经彻底改变了生物分子成像技术。然而，这项技术所依赖的电镜设备价格昂贵且使用复杂，致使许多研究人员无法使用到这项技术。[如，近期上海科技大学招标1套300kV冷冻电镜，预算为5000万元]

 商品化的冷冻电镜产品代表（左：赛默飞Krios G4 ；右：日本电子JEM-Z300FSC）

[更多产品信息：透射电子显微镜专场]

近日，来自OIST的科学家们已经开发出一种更便宜、更用户友好的冷冻电镜，此技术有望将冷冻电镜应用于成千上万的实验室中。

在为期六年的构建过程中，该团队通过在扫描电子显微镜中添加新的成像功能来构建显微镜。他们用混合显微镜对三种不同的生物分子成像:两种形状明显不同的病毒和一种蚯蚓蛋白。

该项研究成果发表在《Ultramicroscopy》，该项研究的共同第一作者之一，量子波显微镜部门(QWM)的研究人员Hidehito Adaniya博士表示，“制作这台显微镜是一个漫长而富有挑战的过程，所以到目前为止，我们对它的结果感到非常兴奋。我们的显微镜不仅更便宜、使用更简单，而且还利用了低能电子，这有可能改善图像的对比度。”

来自QWM的研究人员Hidehito Adaniya博士(左)和Martin Cheung博士(右)展示新的冷冻电镜系统

当前，冷冻电镜的工作原理是向生物样品发射高能电子，电子与生物分子中的原子相互作用并散射，从而改变其方向。然后，散射的电子撞击检测器，并且使用特定的散射图样来建立样品的图像。

但是在高能量下，只有相对较少的散射产生，这是因为电子在加速通过时与样品中原子相互作用非常微弱。

搭建全新冷冻电镜系统部分关键部件

“生物分子主要由低原子质量的元素组成，如碳、氮、氢和氧，”该成果共同研究者Martin张博士解释说，“这些较轻的元素实际上对高速电子是不可见的。”

相比之下，低能电子的移动速度较慢，与较轻元素的相互作用更强，从而可以产生更频繁的散射。

低能电子与较轻元素之间的这种强相互作用很难利用，因为样品周围的冰层也会散射电子，从而产生掩盖生物分子的背景噪声。为了克服这个问题，科学家们对显微镜进行了改装，使其可以切换到另一种不同的成像技术：低温电子全息术。

然而，低能电子与较轻元素之间的这种强相互作用很难驾驭，因为样品周围的冰层也会散射电子，产生掩盖生物分子的背景噪音。为了克服这个问题，科学家们对显微镜进行了改装，使其可以切换到另一种不同的成像技术：低温电子全息术。

扫描电子显微镜的两种常规模式（SEM和STEM；左和中）无法生成生物分子的图像。 但是，全息成像模式（右）可用于成像生物分子，例如所示的烟草花叶病毒。

形成全息图

在全息模式下，电子枪向样品发射一束低能电子，以使一部分电子束穿过冰和样品，形成目标波，而另一部分电子束仅穿过冰，形成参考波。然后，电子束的两个部分彼此相互作用，就像池塘中相互碰撞涟漪一样，形成一种独特的干涉图样-全息图。

在全息成像模式下，电子束包围整个样本，形成参考波和目标波。这些波然后彼此干涉以形成全息图，并由检测器记录下来。

根据全息图的干涉图样，探测器可以区分样本的散射和冰膜的散射。科学家们还可以比较这两部分的电子束，从而从电子中获得额外的信息，而传统的冷冻电镜很难探测到这些信息。

“电子全息术为我们提供了两种不同的信息——振幅和相位，而传统的冷冻电镜技术只能检测相位，” Adaniya博士表示，“这些增加的信息可以使科学家们获得有关样品结构的更多知识。”

图像a显示了噬菌体T4病毒的已知结构。图像b显示记录的全息图。图像c和d是重建图像，分别显示了振幅和相位的对比度。

薄冰的突破

除了构建混合显微镜，科学家们还必须优化样品制备。由于低能电子比高能电子更容易被冰散射，因此包裹样品的冰膜必须尽可能薄，才能最大限度地放大信号。科学家们用水合氧化石墨烯薄片来固定生物分子，从而形成更薄的冰膜。

Cheung表示，科学家还必须采取特殊措施来防止结晶冰的形成，这对冷冻电镜成像是不利的。

当大气中的水蒸气与过冷的样品接触冷却并结晶时，结晶冰就形成了。因此，研究人员必须在一个装满氮气的手套盒中进行准备工作，以防止与水接触。

利用当前建立和优化的样品，显微镜产生了分辨率高达几纳米的图像。研究人员也承认，几纳米的分辨率远低于传统冷冻电镜获得的近原子分辨率。

但即使以目前几纳米的分辨率，此显微镜仍然可以作为预筛查显微镜，以填补重要的市场。Adaniya博士说：“由于低能电子与冰有很强的相互作用，因此，我们更便宜，更友好的显微镜可以帮助研究人员在使用常规冷冻电镜花费宝贵的时间和金钱之前，评估其冰的质量。”

研究人员说，整个过程既快速又简单。 SEM / STEM模式可帮助科学家找到最佳成像点，然后无缝过渡到全息模式。而且，这种模式切换技术可以在其他商用扫描电子显微镜中实现，因此使其成为可广泛采用的成像方法。

将来，研究小组希望通过将电子枪改为能产生更高质量电子束的电子枪来进一步提高图像分辨率。他们表示：“这将是下一步计划。”